近日，天然药物及仿生药物全国重点实验室刘涛教授团队在国际专业期刊《自然-化学生物》 （Nature Chemical biology）上发表了题为“Tracking endogenous proteins based on RNA editing-mediated genetic code expansion” （基于RNA编辑的非经典氨基酸蛋白示踪系统）的最新研究成果。
标记和可视化蛋白质是研究细胞生物学的基本工具，可以用于监测蛋白质动态变化和解析细胞内复杂相互作用，从而理解特定感兴趣蛋白质（protein of interest, POI）的细胞功能。荧光成像技术在活细胞中研究蛋白质定位、功能及互作方面发挥着巨大作用。目前，常用的标记方法都有一定的局限性，例如，抗体染色不能应用于活细胞，而小分子化学探针又缺乏通用型。目前，最常用的是基因融合（使用荧光蛋白、自标记酶或肽标签），但这些方法通常需要过表达编码POI的开放阅读框架（ORF），可能对蛋白质的正常表达、折叠、定位和功能造成干扰。利用基因编辑的方法，原位敲入编码荧光蛋白或特定标记标签，为标记内源蛋白提供了高度精确的方法。然而，该方法可能对细胞造成致命或不可逆的影响，并且需要在POI基因序列编码的N-或C-末端附近进行标签插入，在插入位点选择上也具有局限性。因此，亟需开发一种真正灵活和通用的方法在活细胞水平标记内源蛋白，以填补现有蛋白标记技术的空白。
刘涛教授团队长期以来致力于基因密码子扩展技术、碱基编辑的研究，实现了一系列非经典氨基酸应用（Nature Chemical Biology, 2022, 18, 47; Nature Communications, 2023, 14, 974.）和碱基编辑技术的优化系统（Molecular Cell, 2021, 81, 4747.）。基于团队前期工作基础，团队设计-构建了一种基于RNA编辑和非经典氨基酸的活细胞内源蛋白标记系统（RENAPT），可以在不改变原始基因序列的同时，实现在目标蛋白mRNA水平引入终止密码子，且不受PAM序列的限制。然后通过非经典氨基酸系统，将荧光ncAA或具有生物正交反应手柄的ncAA引入目标位点，仅使用最小的氨基酸侧链标签，实现特异性地标记内源蛋白质（图1）。值得一提的是，RENAPT系统跨越了传统的内源蛋白标记技术，直接在RNA水平对内源目标蛋白进行标记，在活细胞水平，实现细胞器marker蛋白和原代神经细胞中内源蛋白的实时示踪标记，构建了内源蛋白双标记系统，并实现了超分辨成像（图2）。这些实验结果展现了RENAPT系统在内源蛋白标记中的优势，同时也为神经细胞中目标蛋白的标记和超分辨成像提供了新的平台，期待未来科学家能够进一步拓展该系统在其他方面的应用。
图1 研究设计原理
图2 代表性标记成果展示。a.细胞器marker蛋白；b.原代神经细胞中内源蛋白；c.内源蛋白双标记; d. 超分辨成像。
该论文第一作者为博士后郝敏，博士生凌鑫宇和讲师孙懿，通讯作者为刘涛教授。团队成员王雪，常丽颖，曾志英，牛梦晓，天然药物及仿生药物国家重点实验室仪器平台指导老师李文哲、师晓萌、姜竺君和张晓辉也为本研究做出了重要贡献。北京大学陈良怡教授为本研究做出了重要技术支持。北京大学药学院和天然药物及仿生药物全国重点实验室为第一通讯单位。该研究获得中国国家重点研发计划、国家自然科学基金、国家科技重大专项计划、中国博士后科学基金和北京市自然科学基金等项目的支持。
论文链接
https://www.nature.com/articles/s41589-023-01533-w
作者简介
郝敏 博士：
郝敏于2015年进入天津大学化工学院，制药工程专业学习，导师：齐浩和乔建军 教授，获博士学位。2020年进入北京大学药学院-天然药物及仿生药物全国重点实验室进行博士后的研究工作，合作导师：刘涛 教授。研究方向碱基编辑、非经典氨基酸整合技术等。已在Nat Chem Biol , Commun. Biol等期刊发表多篇论文。获得北京大学博雅博士后，主持中国博士后科学基金等。
刘涛 教授：
刘涛，北京大学博雅特聘教授，博士生导师，分子与细胞药理系主任，天然药物及仿生药物国家重点实验室PI，化学生物学交叉中心PI，北大医学-惠大基因密码子创新联合实验室负责人。国家杰出青年基金获得者、国家海外高层次青年人才、国家自然科学基金获得者、国家优秀青年科学基金获得者、北京市杰出青年基金获得者。任中国医药生物技术协会委员合成生物学分会委员，中国生物医学工程学会青工委委员，获中国药学会以岭生物医药青年奖，拜耳研究员奖，北大王选青年学者奖等。以通讯作者身份在Nat Chem Biol、Mol Cell、Nat Commun、Sci Adv、JACS、Angew Chem、Chem等国际高水平期刊发表一系列研究论文。担任Journal of Molecular Biology编委，Chinese Chemical Letter编委等。研究集中在蛋白质药物化学修饰，基因编辑与细胞治疗，发展了含有人造氨基酸的蛋白质创新药物，应用在肿瘤及细胞治疗等多种领域，从而促进了生物药物的升级换代。
(药学院）