2023年6月15日，北京大学药学院刘涛课题组与南方科技大学蒋伟课题组合作在Chem杂志在线发表了题为“Reversible control of tetrazine bioorthogonal reactivity by naphthotube-mediated host-guest recognition”的研究论文，报道了四嗪生物正交反应活性可逆调控的策略，并进行相关生物医学应用。
生物正交化学反应是指能够在生物体系中进行、且不会与天然生物化学过程相互干扰的一类化学反应，它为科学家对生命进程的原位研究带来了革命性的技术, 已经成为化学生物学这一新兴交叉领域的核心方向之一，也因此于2022年获得诺贝尔化学奖。其中四嗪参与的生物正交反应——逆电子需求的Diels–Alder（IEDDA）反应，以其超快的反应速率、温和的反应条件和极好的生物相容性，被广泛应用于生命医学研究，如对抗体进行药物的偶联修饰、肿瘤探针的预靶向，也有利用该反应进行前药激活的阿霉素药物在进行临床试验，对该反应的精确调控也具有着重要意义[1]。然而，目前的调控方式大多局限于光催化或电化学的手段，对生物体具有毒性，且操作不便。因此，对四嗪的反应活性进行简便、无毒且高效地调控，是是亟待解决的科学难题。
针对以上问题，2023年6月15日，北京大学药学院刘涛教授课题组与南方科技大学蒋伟教授课题组在Chem在线发表了题为“Reversible control of tetrazine bioorthogonal reactivity by naphthotube-mediated host-guest recognition”的研究论文[2]。在这项工作中，刘涛团队基于自己之前使用超分子主体靶向蛋白表面以氨基酸侧链形式存在的客体的研究[3]，以及蒋伟团队发现的能与苯基嘧啶有高亲和力的超分子萘管[4]，开发了萘管识别四嗪并调控其生物正交反应活性的策略（图1）。该策略通过萘管主体与四嗪客体的分子识别来调控四嗪的生物正交反应活性。萘管能以高亲和力识别各种生物分子上的苯基四嗪，从而以可逆的方式有效地抑制它们的生物正交反应活性。这种策略简便高效且生物相容性极好，为生物正交反应在生物医药领域的应用提供了新思路。
图1 四嗪生物正交反应可逆调控的示意图
主要研究内容：
1实现四嗪生物正交反应在多种生物大分子上的可逆调控
理论计算及实验均验证了萘管能与苯基四嗪有高亲和力，并且该结合能够有效抑制四嗪的反应活性。这种分子识别对于不同的分子上修饰的四嗪都十分有效，包括荧光分子、糖、氨基酸、核酸和蛋白质。并且，被包笼四嗪的反应活性可以通过加入与萘管有高亲和力的竞争性小分子实现恢复。（图2）。
图2 实现四嗪生物正交反应在多种生物大分子上的可逆调控
2 顺序IEDDA反应的策略实现抗体精准多位点修饰及抗体药物荧光双偶联
通过将四嗪做成氨基酸侧链的形式，四嗪氨基酸可以被基因编码、参与蛋白质的翻译，实现对蛋白质的定点四嗪修饰。而通过理论计算与实验测定，萘管只能识别在蛋白表面充分暴露在溶剂中的“站式”四嗪氨基酸，而不能识别贴在表面的“躺式”四嗪氨基酸，而二者本身都具有生物正交反应活性。因此，可通过先对“站式”四嗪氨基酸的包笼，让“躺式”四嗪氨基酸先进行生物正交反应，然后通过竞争性小分子的加入，让“站式”的四嗪氨基酸参与新的分子介导的生物正交反应。这种顺序IEDDA反应可以实现在插入多个四嗪氨基酸的蛋白质中进行快速定点的生物正交反应多修饰。
鉴于抗体药物偶联物（Antibody-drug conjugates, ADC）广泛应用于临床治疗，且因抗体蛋白稳定性差，温和快速的IEDDA反应十分适用于制备抗体小分子偶联物。因此这样的顺序IEDDA反应首先应用于对于抗体的温和快速多标记。通过表达包含多个四嗪氨基酸的抗体并进行顺序IEDDA反应，定点修饰的长效荧光抗体以及荧光抗体药物偶联物得以制备，且其生物活性得到表征（图3）。
图3 顺序IEDDA反应的策略实现抗体精准多位点修饰及抗体药物荧光双偶联
3 顺序IEDDA反应实现活细胞多靶点高效成像
四嗪IEDDA反应由于其温和快速的特点，被广泛应用于活细胞的标记。而本研究所用的调控元件也具有极好的生物相容性。通过细胞自身表达多种含四嗪氨基酸的蛋白，顺序IEDDA反应可以实现对同一活细胞内多种蛋白迅速且温和的定点修饰与标记（图4）。
图4 顺序IEDDA反应实现活细胞多靶点高效成像
4 小鼠活体内实现四嗪生物正交反应活性的可逆调控
四嗪IEDDA反应速率很高，且反应条件温和，这使得它可以用于活体内的反应。萘管也具有极好的生物相容性并曾用于小鼠活体实验[5]。因此，本文也进行了在小鼠活体内调控四嗪生物正交反应活性的实验（图5）。
图5 小鼠活体内实现四嗪生物正交反应活性的可逆调控
本研究开发了一种对四嗪生物正交反应的可逆调控策略，通过萘管主体与四嗪客体的分子识别来调控四嗪的生物正交反应活性，并证明其适用于多种生物分子上的四嗪，流程简便且无毒性。并且通过顺序IEDDA反应的策略，该调控体系首先被用于抗体精准多位点修饰，并成功制备抗体药物荧光定点双偶联物用于检测与治疗，然后实现了哺乳动物活细胞多靶点温和快速的高效成像，最后还成功实现了小鼠活体水平反应的调控，证明了其用于体内治疗过程的巨大潜力。该策略为生物正交反应在生物医药领域的应用提供了新思路。
北京大学药学院刘涛教授为本文的通讯作者。南开大学联合培养2015级博士生（已毕业）曹文兵、北京大学药学院2018级六年制学生王浩宇、深圳大学材料学院副研究员权茂为本文共同第一作者。
参考文献
1. Oliveira, B.L., Guo, Z., and Bernardes, G.J.L. (2017). Inverse electron demand Diels–Alder reactions in chemical biology. Chem. Soc. Rev. 46, 4895–4950. 10.1039/C7CS00184C.
2. Cao, W., Wang, H., Quan, M., Li, Y., Su, Y., Li, Y., Jiang, W., and Liu, T. (2023). Reversible control of tetrazine bioorthogonal reactivity by naphthotube-mediated host-guest recognition. Chem, S2451929423002656. 10.1016/j.chempr.2023.05.034.
3. Cao, W., Qin, X., Wang, Y., Dai, Z., Dai, X., Wang, H., Xuan, W., Zhang, Y., Liu, Y., and Liu, T. (2021). A general supramolecular approach to regulate protein functions by cucurbit[7]uril and unnatural amino acid recognition. Angew. Chem. Int. Ed. 60, 11196–11200. 10.1002/anie.202100916.
4. Ma Yan-Long, Quan Mao, Lin Xiu-Lian, Cheng Qian, Yao Huan, Yang Xi-Ran, Li Ming-Shuang, Liu Wei-Er, Bai Lin-Ming, Wang Ruibing, et al. (2020). Biomimetic recognition of organic drug molecules in water by amide naphthotubes. CCS Chem. 3, 1078–1092. 10.31635/ccschem.020.202000288.
5. Ma Yan-Long, Sun Chen, Li Zeshun, Wang Ziyi, Wei Jianwen, Cheng Qian, Zheng Li-Shuo, Chang Xiao-Yong, Li Kai, Wang Ruibing, et al. (2021). Biomimetic recognition-based bioorthogonal host–guest pairs for cell targeting and tissue imaging in living animals. CCS Chem. 4, 1977–1989. 10.31635/ccschem.021.202101178.
作者简介
刘涛，博士，北京大学药学院长聘研究员，博士生导师，分子与细胞药理系主任，天然药物及仿生药物国家重点实验室PI，化学生物学交叉中心PI，北大医学-惠大基因密码子创新联合实验室负责人。国家海外高层次青年人才、国家优秀青年科学基金获得者、北京市杰出青年基金获得者。任中国医药生物技术协会委员合成生物学分会委员，中国生物医学工程学会青工委委员，获中国药学会以岭生物医药青年奖，拜耳研究员奖，首届屠呦呦青年学者奖，北大王选青年学者奖等。以通讯作者身份在Nat Chem Biol、Mol Cell、Nat. Commun、Sci Adv、Chem、JACS、Angew Chem等国际高水平期刊发表一系列研究论文。担任Journal of Molecular Biology编委，Chinese Chemical Letter编委等。研究集中在蛋白质药物化学修饰，基因编辑与细胞治疗，发展了含有人造氨基酸的蛋白质创新药物，应用在肿瘤及细胞治疗等多种领域，从而促进了生物药物的升级换代。
蒋伟，博士，原南方科技大学化学系、深圳格拉布斯研究院双聘教授，博士生导师。国家杰出青年基金获得者、国家优秀青年基金获得者、国家海外高层次青年人才、英国皇家化学会会士、深圳市“鹏城学者”特聘教授。获中国化学会“超分子化学青年创新学术讲座奖”，大环芳烃超分子化学“学术新星奖”，德国先令基金会“先令奖”等。以通讯作者身份在Nat. Chem.、Nat. Commun.、JACS、Angew. Chem. Int. Ed.、CCS Chem.等国际高水平期刊发表一系列研究论文。担任Chinese Chemical Letter青年编委、中国化学会高级会员等。研究集中在仿生分子识别，新型大环主体开发，并将其应用于环境污染物检测与治理、ee值光谱测量、神经毒气的解毒、药物增溶、分子机器、智能材料等多种领域。
(药学院）